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SOLUCIÓN TRIPSINA EDTA
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UTILIZACIÓN:
PARA REMOVER CÉLULAS DE CULTIVOS ADHERIDAS AL FRASCO:
1. Remueva por inversión o por aspiración todo el medio del frasco de cultivo.
2. Adicione cerca de 0,1 ml/cm2 de la solución de Tripsina/EDTA para lavar rápidamente la superficie de células. Esa maniobra es rápida y sirve para remover el suero remaneciente. Se puede utilizar medio de cultivo o solución balanceada en mayor cantidad, pero sin suero, lo que permitirá más economía de Solución de Tripsina.
3. Adicionar cerca de 0,05 ml/cm2 de la Solución de Tripsina/EDTA por debajo de la superficie celular y observar al microscopio.
Cuando las células adquieran un aspecto redondo e individualizado, desprendiéndose del tubo, el proceso puede ser interrumpido con la adición de 0,2 ml/cm2 de medio con suero al 10%. Como el suero posee alfa 1-anti-tripsina, este neutralizará la acción de la tripsina. Cuando se trabaja con monocapas celulares que ocupan todo el frasco, el desprendimiento puede ser observado a ojo limpio y el medio se presentará como si tuviese una arena fina. Es importante que la neutralización con suero se haga inmediatamente después del desprendimiento de la capa celular, ya que la membrana es lipoproteíca y sufre la acción protelítica de la tripsina.
4. Enseguida, las células son homogenizadas y contadas para dilución, congelamiento, repiques celulares, etc.
PARA REMOVER CÉLULAS DE ÓRGANOS O TEJIDOS:
1. Lavar bien el órgano o tejido en medio sin suero.
2. Con el auxilio de una tijera de iris, picar el órgano en pedazos bien pequeños (+1mm).
3. Aspirar todo el sobrenadanete (los pedazos generalmente no flotan)
4. Adicionar Tripsina/EDTA, un volumen de 3 a 10 veces el correspondiente al tejido picado.
5. Agitar lentamente en un Erlenmayer, con la ayuda de un agitador magnético con imán revestido de PTFE y estéril. El tiempo de recolecta de la Tripsina con células puede tener intervalos de 10, 20 á 30 minutos.
6. Después del tiempo de acción de la Tripsina, aspirar el sobrenadante y colocarlo en tubos con medio completo con suero al 10%. La proporción será de 1 para 1, o sea, para cada 10 ml de sobrenadante, mezclar otro ml de medio completo con suero. Note que la extracción de células del Erlenmayer podrá continuar siendo hecha, pues solo es necesario adicionar más Tripsina/EDTA.
7. Centrifugar por 10 minutos a 1000 RPM los tubos con Tripsina con medio completo, despreciar el sobrenadante y agregar nuevo medio completo.
8. Homogenizar y distribuir las células en frascos de cultivo, de acuerdo con la vitalidad y densidad celular deseada.
PRESENTACIÓN : frascos de 75 ml con tripsina (2,5g/L) con actividad 1:250
VALIDAD : 12 meses
CONSERVACIÓN : de 0 a -20°C
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DEFINICIÓN: es una solución balanceada con tripsina, sin iones calcio y magnesio y con un agente quelante.
ACCIÓN: actúa permitiendo el desprendimiento de las células de frascos de cultivo y/o desagregando células entre si, por medio de su propiedad proteolítica sobre las proteínas intercelulares. También altera la estabilidad de las membranas al quelar el ión calcio.
INDICACIÓN: esta solución es utilizada para la separación de células de órganos o tejidos y aún de aquellas cultivadas en mono o multicapas.
VENTAJAS: como el proceso de desprendimiento y separación de células puede ser acompañado por microscopio, este puede ser controlado interrumpiendo su acción por medio de la simple adición de medio conteniendo suero animal o humano.
CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS:
1.) Aspecto : róseo, límpido y transparente
2.) pH : 7,0 + 0,2
3.) Osmolaridad : 295 + 5%
CONSERVACIÓN: descongelar apenas en el momento de uso y congelar nuevamente. Como es una enzima proteolítica, puede sufrir autodigestión lo que disminuye su actividad. La alteración para valores más próximos de 7,9 (más róseo) y su utilización a 37°C provocan aumento de su actividad, lo contrario sucede con la reducción del pH y de la temperatura. |
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